本发明涉及一种多年冻土区一氧化二氮通量估算方法，包括以下步骤：S1Ecosys合成数据准备，对Ecosys模型合成数据进行处理；S2初级知识引导型机器学习模型开发；⑴建立知识引导型机器学习模型Ⅰ和Ⅱ；⑵线性神经网络层Ⅰ和Ⅱ用于将最终输出映射到N2O通量；⑶预测N2O通量的关键变量选择，并创建两种输入组合；S3初级知识引导型机器学习模型本领域专业知识学习；S4高级知识引导型机器学习模型的实际观测数据驯化；S5高级知识引导型机器学习模型适用性和过拟合测试；S6高级知识引导型机器学习模型基准测试和稳定性测试，得到多年冻土区一氧化二氮通量估算模型。本发明可减少传统基于过程模型输出和观测之间的偏差，提供更精确、可靠的多年冻土区N2O通量计算结果。